Robuste Kontrollstrategien für AAVs: Einsatz von QbD innerhalb der regulatorischen Rahmenbedingungen
Die Entwicklung und Herstellung von Gentherapieprodukten, insbesondere solchen auf Basis von Adeno-assoziierten Viren (AAVs), stellen besondere Herausforderungen hinsichtlich der Gewährleistung einer gleichbleibenden Produktqualität, -sicherheit und -wirksamkeit dar.
Da sich der Bereich der Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMPs) ständig weiterentwickelt, werden die regulatorischen Anforderungen zunehmend durch etablierte Rahmen wie die Richtlinien des International Council for Harmonisation (ICH) und die ATMP-Richtlinien der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA), der United States Pharmacopeia (USP), der Europäischen Arzneimittelagentur (EMA) und anderer relevanter Aufsichtsbehörden geprägt.
Insbesondere die ICH-Richtlinien Q8 (Arzneimittelentwicklung), Q9 (Qualitätsrisikomanagement) und Q10 (Arzneimittelqualitätssystem) bieten eine gute Orientierung bei der Entwicklung des Herstellungsprozesses und der zugehörigen Kontrollstrategie. Im Bereich Biologika und Impfstoffe wurden diese Konzepte seit Jahrzehnten etabliert und erfolgreich angewendet. Aufgrund der Komplexität des Herstellungsprozesses und der Endprodukte von ATMP spiegelt sich die vergleichsweise noch begrenzte CMC-Wissensbasis (Chemistry, Manufacturing, and Controls) in der Häufigkeit von regulatorischen Einwänden und Ablehnungen von Anträgen wider1.
Die ICH Q10 definiert die Kontrollstrategie als eine Reihe von Kontrollen, die aus dem Verständnis des Produkts und des Prozesses abgeleitet werden und von der Prozessleistung und Produktqualität ausgehen.
Es können fünf zentrale kritische Qualitätsmerkmale zugewiesen werden: Identität, Reinheit, Sicherheit, Gehalt (physikalisch-chemische Charakteristiken) und Wirksamkeit, um die Produktqualität, Wirksamkeit und Patientensicherheit zu gewährleisten.
Es gibt zwei wesentliche Unterschiede zwischen dem Herstellungsprozess von viralen Produkten und dem von biologischen Produkten:
- Der Herstellmaßstab
- Die Anzahl der Prozessschritte
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Die hohe Virusausbeute in den Virusproduktionszellen und die geringe Anzahl von Patienten bei diesen seltenen genetischen Erkrankungen ermöglichen es, mehrheitlich im Labormaßstab bei der Wirkstoffherstellung und deren Aufreinigung zu arbeiten. Mit einem geringen Aufwand für den Herstellungsprozess kann man bereits den entsprechenden medizinischen Bedarf decken. Darüber hinaus ist der Prozess der In-vivo-Gentherapie (GT) im Vergleich zu biologischen Produkten kleiner und umfasst weniger Prozessschritte. Trotz der Komplexität des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV)-Produkts und seines Verunreinigungsprofils sind weniger Prozessschritte erforderlich. Eine Darstellung finden Sie in Abbildung 1 auf Seite 8.
Abbildung 1: Vergleich des suspensionsbasierten Herstellungsprozesses zwischen mAb (A) und AAV (B) von USP bis DP
Abkürzungen: AAV Adeno-assoziiertes Virus, AEX Anionenaustauschchromatographie, AFC Affinitätschromatographie, C Zentrifugation, CEX Kationenchromatographie, CHO Chinesischer Hamster-Ovar, CL Klärung, DP Arzneimittel, HEK Menschliche embryonale Niere, DF Tiefenfiltration, mAbs Monoklonale Antikörper, SF Sterilfiltration, TFF Tangential flussfiltration, UF Ultrafiltration VI Virale Inaktivierung
Über den ICH-Rahmen hinaus haben sowohl die EMA als auch die FDA zusätzliche Leitlinien speziell für Gentherapieprodukte herausgegeben. Dazu gehören allgemeine Rahmenwerke sowie produktspezifische Dokumente wie die Leitlinien der EMA und der Leitlinienentwurf der FDA zur Wirksamkeits-Prüfung die die zunehmende Bedeutung der Nachweisbarkeit der Produktfunktionalität und -konsistenz für die Zulassung hervorheben.
Die in ICH Q8, Q12 und insbesondere Q14 dargelegten Grundsätze von Quality by Design (QbD) spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von AAV-Produkten. Durch die Integration von Risikobewertungen während des gesamten Lebenszyklus des Arzneimittels unterstützt QbD die Optimierung sowohl der Herstellungsprozesse als auch der Analysemethoden und trägt letztendlich zu einem besser vorhersagbaren und kontrollierten Produktprofil bei.
Dieser Artikel untersucht, wie diese regulatorischen und wissenschaftlichen Grundsätze zusammenwirken, um die Kontrollstrategien für AAV-basierte Gentherapien zu gestalten, wobei der Schwerpunkt auf der Identifikation und Justierung der CQAs durch den Einsatz von QbD an die sich fortlaufend entwickelnden Erwartungen und der Erleichterung einer erfolgreichen Produktentwicklung und -zulassung liegt.
Die Komplexität von AAV-basierten Gentherapieprodukten erfordert äußerst robuste, zuverlässige und gut charakterisierte Analysemethoden. Quality by Design (QbD) bietet mit seinem systematischen, wissenschaftlich fundierten und risikobasierten Ansatz eine Lösung, die das Verständnis und die Kontrolle der Methode während des gesamten Produktlebenszyklus verbessert.
Basierend auf dem Quality Target Product Profile (QTPP) ist das daraus resultierende Analytical Target Profile (ATP) eine klare Aussage über den beabsichtigten Zweck und die Leistungskriterien der Methode. Für AAVs umfasst dies die Quantifizierung des viralen Genomtiters, die Bewertung der Kapselintegrität und die Messung der Wirksamkeit. Das ATP bildet die Grundlage für die Methodengestaltung und -validierung und gewährleistet die Übereinstimmung mit den CQA des Produkts.
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Kritische Methodenattribute (CMAs) sind die messbaren Eigenschaften einer Analysemethode, die kontrolliert werden müssen, um das ATP zu erfüllen. Bei einem qPCR-Assay für den Genomtiter können CMAs beispielsweise die Amplifikationseffizienz, die Spezifität und die Linearität umfassen. Das Verständnis dieser Attribute hilft dabei, Methodenparameter zu priorisieren, die die Leistung beeinflussen.
Mithilfe von Tools zur Risikobewertung und Methodenentwicklung wie Ishikawa-Diagrammen, Fehlermöglichkeits- und Einflussanalysen (FMEA) oder Versuchsplänen (DoE) können Entwickler die Auswirkungen von Methodenparametern (z. B. Reagenzienkonzentration, Temperatur oder pH-Wert) auf CMAs systematisch bewerten. Dieser Schritt ist entscheidend für die Identifizierung kritischer Methodenparameter (CMPs) und das Verständnis ihrer Wechselwirkungen.
DoE ermöglicht eine effiziente Erforschung des Methodendesignraums, sodass Entwickler CMPs optimieren und einen Method Operable Design Region (MODR) definieren können einen mehrdimensionalen Raum, in dem die Methode die ATP konsistent erfüllt. Robuste Tests stellen sicher, dass die Methode unter kleinen, absichtlichen Abweichungen zuverlässig funktioniert.
QbD endet nicht mit der Methodenvalidierung. Gemäß ICH Q12 unterliegen analytische Methoden einem Lebenszyklusmanagement, bei dem die Leistung über einen bestimmten Zeitraum hinweg mithilfe von Trendanalyse-Tools und Kontrollkarten überwacht wird. Dieser proaktive Ansatz unterstützt die kontinuierliche Verbesserung und erleichtert Änderungen nach der Zulassung bei geringerer regulatorischer Belastung.
Die Vorteile von QbD in der analytischen Entwicklung von AAV sind:
- Verbessertes Verständnis und bessere Kontrolle der Methoden
- Verbesserte Einhaltung gesetzlicher Vorschriften durch strukturierte Dokumentation und Risikomanagement
- Größere Robustheit der Methoden, wodurch Variabilität und Ergebnisse außerhalb der Spezifikationen reduziert werden
- Erleichterter Technologietransfer und Skalierbarkeit über alle Entwicklungsstufen hinweg
Im Bereich der Gentherapie hat das Qualitätsmanagement auf der Grundlage der QbD-Prinzipien (ICH Q8 und ICH Q12) zunehmend an Bedeutung gewonnen, insbesondere auf molekularer Ebene, da das Arzneimittel aus einem viralen Nukleinsäure-Template besteht und die aktiven Moleküle innerhalb der vorgesehenen Zielzellen synthetisiert werden. Ein weiterer Aspekt, der für den Bereich der Gentherapie einzigartig ist, ist seine zelluläre Dimension. Der QbD-Rahmen erstreckt sich nicht nur auf die Nukleinsäure-Matrize selbst, sondern auch auf die zellulären Prozesse, die der Biosynthese der aktiven transgenen Moleküle zugrunde liegen. Folglich muss die Korrelation zwischen diesen intrazellulären Biosyntheseprozessen und den relevanten Qualitätsattributen innerhalb der Zielzellen gleichzeitig berücksichtigt werden.
Ein Vorschlag für eine zelluläre Unterscheidung der Qualitätsmerkmale von rekombinantem AAV auf der Grundlage einer dreifachen Transfektion/Plasmidherstellung ist in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2: Zelluläre Qualitätsmerkmale des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV)
(A) Extrazelluläre Merkmale auf dem Helferplasmid und (B) intrazelluläre Merkmale auf molekularer
Ebene (DNA und mRNA)
Abkürzungen: Cap Kapsid, ds doppelsträngig, ITR invertierte terminale Wiederholung, PR/p Promotor, Rep Replikation, ss
einzelsträngig, UTR untranslatierte Region
Daher wird der Begriff QbD in diesem Fall sogar wörtlich verstanden und erfordert einen ganzheitlichen Ansatz, der die Verarbeitungsschritte des Zell- und Bioprozesses und deren kombinierte Auswirkungen auf die klinische Wirksamkeit berücksichtigt.
Jegliche potenziellen Qualitätslücken auf molekularer Designebene können sich auf die zellulären Verarbeitungsschritte und in der Folge auf die klinische Wirksamkeit auswirken. Drei wesentliche intrinsische Merkmale, die sich aus der nukleären DNA-Matrize für GT-Produkte ableiten, sind:
- Motive und Primärsequenzen (zelluläre Faktor-Bindungsmotive, Expressionsregulation, Expression, Pathogen-Bindungsmotive, Immunogenität, Verpackung, Sonstiges)
- Höhergeordnete Strukturen der Template-DNA und ihrer Primärprodukte (mRNA/RNAs)
- Funktionalität des transgenen Ladeguts (Expression, Funktionalität, Wirksamkeit)
In den letzten Jahrzehnten hat sich die In-silico-Analyse zu einem unverzichtbaren Werkzeug der Arzneimittelforschung für die Identifizierung potenzieller Zielmoleküle entwickelt2, 3, 4. In der Proteomik haben zahlreiche Werkzeuge und Anwendungen die erfolgreiche Entwicklung proteinbasierter Arzneimittel und deren medizinische Umsetzung vorangetrieben.
Eine weitere vielversprechende Anwendung sind Multi-Omics-/In-Silico-Modelle, die Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik als Datenerfassungswerkzeuge umfassen. Sie tragen zur Verbesserung des rAAV-Herstellungsprozesses bei, indem sie spezifische Produzentenzelllinien nach transienter Transfektion analysieren4 5.
Auf der ATMP-Seite, beispielsweise bei AAV-basierten Therapeutika, haben ein zunehmendes Produktverständnis, verbesserte Herstellungsprozesse in Bezug auf Reinheit und Ausbeute sowie neue analytische Ansätze und Technologien das Wissen über die entsprechenden zellulären Qualitätsmerkmale vertieft. Diese Fortschritte trugen zur sequenziellen Modulation der spezifischen Motive und Primärsequenzen bei, die an Zelleintritt, Promotorregulation, Transkription, Expression, Verpackung, Verarbeitung und Transport sowie Immunität beteiligt sind6, 7, 8, 9, 10.
Präzisere Vorhersagen der intrazellulären Verarbeitung in Abhängigkeit von den transgenen Sequenzen (Expressionskassette) würden eine bessere Modifizierung der entsprechenden zellulären Qualitätsmerkmale ermöglichen (Abb. 2), was dazu beitragen würde, produktbezogene Verunreinigungen und Produktvarianten zu reduzieren oder zu vermeiden4, 7, 11.
Ein weiterer entscheidender intrinsischer Faktor ist die Struktur höherer Ordnung der DNA-Matrize und ihrer Primärprodukte, die die zellulären Eigenschaften stark beeinflussen (Abb. 2). Die Identifizierung der für solche Strukturen verantwortlichen Nukleinsäuresequenzen und das Verständnis ihrer potenziellen Bildung könnten die Vorhersage dieser höheren Faltungen der Gentherapie-Matrize und ihres primären RNA-Produkts ermöglichen. Entsprechende rechnergestützte Werkzeuge sind unerlässlich und werden bereits auf der Ebene der Sekundärstruktur12, 13 und der Tertiärstruktur14, 15 eingesetzt.
Mit Ausnahme einiger weniger biologischer RNAs werden unter quaternären Nukleinsäurestrukturen meist DNA/RNA-Protein-Komplexe verstanden16, 17, 18.
Im Allgemeinen wird empfohlen, bei der Entwicklung und Auswahl hochzuverlässiger Prognoseverfahren19, entsprechenden Tests zu ihrer statistischen Signifikanz und robusten Datensätzen20 verstärkt patientenorientierte Qualitätsaspekte wie bei Impfstoffen zu berücksichtigen. Manchmal kann auch eine experimentelle Überprüfung erforderlich sein21. Die Auswirkungen potenzieller Modifikationen/Veränderungen der transgenen Sequenzen können durch Risikobewertungen wie in ICH Q9 und ICH Q14 beschrieben, behandelt werden.
Ein harmonisierter Ansatz innerhalb der Branche in Bezug auf standardisierte Instrumente, die Gestaltung und Nutzung entsprechender Datenbanken ist wünschenswert. Investitionen in die Qualität auf molekularer Ebene verhindern spätere arbeits- und kostenintensive Anstrengungen bei der CMC-Herstellung.
Im Zusammenhang mit den Zeitplänen von Entwicklungsprojekten könnte ein optimaler Zeitpunkt für die Qualitätsprüfung der drei wesentlichen Merkmale während der Leitstrukturauswahl vor Beginn der toxikologischen Studien liegen.
Der zunehmende Einsatz von KI und die kontinuierliche Weiterentwicklung von Prognosetools könnten die Schätzungen zuverlässiger machen22.
Investitionen in die Verbesserung der Zellqualität auf molekularer Ebene können zu erheblichen Kosteneinsparungen durch eine schlankere Fertigung, ein schlankeres Kontrollpanel, ein verbessertes Sicherheitsprofil und eine potenziell höhere Wirksamkeit führen.
Es besteht nicht nur Bedarf an spezifischeren Regulierungsdokumenten und Richtlinien in Bezug auf schädliche Sequenzen/Motive sowie sicherheits- und wirksamkeitsrelevante Sequenzen, sondern auch an harmonisierten Konzepten und Standards, die die Gestaltung und den Umgang mit diesen zellulären Qualitätsmerkmalen berücksichtigen.
Kurz gesagt: Im Gegensatz zu Biologika und Impfstoffen erfolgt die Definition der Produktqualität bei GT-basierten Produkten (wie AAV) bereits in der präklinischen Phase. Hauptgrund für diese Verschiebung ist das molekulare Design der transgenen Nukleinsäuresequenz. Darüber hinaus wirken sich auch kürzere Zeiträume bis zum Eintritt in die Phase I (Entry into Human) auf die CMC-Aktivität und die damit verbundene Produktqualität aus. Daher wird eine frühzeitige Berücksichtigung dieser CMC-Entwicklungsaspekte in der präklinischen Phase zu einem reibungslosen Übergang in spätere klinische Phasen und zur guten Herstellungspraxis führen.
Über die Autoren:
Dr. Ulrike Herbrand
... kam 2007 zu Charles River Laboratories. Sie ist wissenschaftliche Direktorin für globale In-vitro-Bioassays und Leiterin des Teams für Bioassay-Forschung und -Entwicklung am Standort von Charles River Laboratories in Erkrath, Deutschland.
Dr. Roland Pach
... ist seit mehr als 10 Jahren globaler CMC Analytical Technical Lead im Bereich Krebsimpfstoffe und Zell- und Gentherapie (CGT) bei Roche. Er vertritt Roche in externen Entwicklungsprojekten und zahlreichen Due-Diligence-Prüfungen von Lizenzkandidaten oder Unternehmen im CGT-Bereich.
Fußnoten:
1 Barkholt L et al., European regulatory experience with advanced therapy medicinal products. Nat Rev Drug Discov 18, 8-9 (2019)
2 Murray, D, Doran, P, MacMathuna, P. et al. In silico gene expression analysis an overview. Mol Cancer 6, 50 (2007)
3 Miah Roney et al., The importance of in-silico studies in drug discovery, Intelligent Pharmacy 2, 578-579 (2024)
4 Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S, Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng.120, 2601-2621 (2023)
5 Esse R et al., Multi-omics data integration to improve adeno-associated vector (AAV) manufacturing. Cytotherapy 26, S133 (2024)
6 Large EE et al. Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Delivery: Dissecting Molecular Interactions upon Cell Entry. Viruses 13, 1336 (2021)
7 Maurer AC, Weitzman MD. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Hum Gene Ther. 31, 499-511 (2020)
8 Dhungel, BP et al., Journey to the Center of the Cell: Tracing the Path of AAV Transduction. Trends in Molecular Medicine 27, 172 - 184 (2021)
9 Srivastava A, Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy.Molecular Therapy - Nucleic Acids 32, 949-959 (2023)
10 Keeler AM er al., The curious case of AAV immunology. Mol Ther. 33, 1946-1965 (2025)
11 Xie J et al., Short DNA Hairpins Compromise Recombinant Adeno-Associated Virus Genome Homogeneity. Mol Ther. 25, 1363-1374 (2017)
12 Afzal M et al, RDNAnalyzer: A tool for DNA secondary structure prediction and sequence analysis. Bioinformation 8, 687-90 (2012)
13 Sato, K, Akiyama, M & Sakakibara, Y RNA secondary structure prediction using deep learning with thermodynamic integration. Nat Commun 12, 941 (2021)
14 Kagaya, ., Zhang Z, Ibtehaz, N et al. NuFold: end-to-end approach for RNA tertiary structure prediction with flexible nucleobase center representation. Nat Commun 16, 881 (2025)
15 Zhang Y, Xiong Y, Yang C, Xiao Y, 3dRNA/DNA: 3D Structure Prediction from RNA to DNA. Journal of Molecular Biology 436, 168742 (2024)
16 Jones CP, Ferré-D'Amaré AR. RNA quaternary structure and global symmetry. Trends Biochem Sci. 40, 211-20 (2015)
17 Li, J., Chiu, TP. & Rohs, R. Predicting DNA structure using a deep learning method. Nat Commun 15, 1243 (2024)
18 Marklund E, Ke Y, Greenleaf WJ. High-throughput biochemistry in RNA sequence space: predicting structure and function. Nat Rev Genet. 24, 401-414 (2023)
19 Mathur G, Pandey A, Goyal S. A comprehensive tool for rapid and accurate prediction of disease using DNA sequence classifier. Ambient Intell Humaniz Comput., Jun 25:1-17 (2022)
20 Magnus, M. et al. RNA-Puzzles toolkit: a computational resource of RNA 3D structure benchmark datasets, structure manipulation, and evaluation tools. Nucleic Acids Res. 48, 576 588 (2020)
21 Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. et al. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nat Methods 19, 1193 1207 (2022) a
22 Chaturvedi M, Rashid MA, Paliwal KK. Transformers in RNA structure prediction: A review. Comput Struct Biotechnol J 27, 1187-1203 (2025)
