Nachweis der Methodentauglichkeit eines ATP-Biolumineszenz- Schnelltests für mikrobielle Kontaminationen in biologischen Produkten

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Wie jeder industrielle Mikrobiologe weiß, enthalten alle lebenden Zellen ATP (Adenosintriphosphat), und die Unterscheidung von mikrobiellem ATP- und zellulärem ATP-Gehalt stellt eine Herausforderung für die Entwicklung von Testmethoden dar, die den Nachweis von mikrobiellem ATP zur Interpretation eines mikrobiellen Kontaminationsereignisses erfordern. Der folgende Artikel befasst sich speziell mit dieser Problematik bei der Prüfung biologischer Produkte und stellt auch Zelllinien- Testdaten als Beispiele für erfolgreiche Testmethoden vor.

Betrachten wir als Beispiel den Prozess der Biologikaherstellung, vor allem im Zusammenhang mit den Erntepools. Es ist dabei wichtig zu bedenken, wo mikrobiologische Screening- Punkte kritisch werden und wie Hersteller das Risiko durch die Implementierung eines ATP-Biolumineszenz-Echtzeittests während des Prozesses mindern können.

In der folgenden Abbildung beginnt die Biologikaproduktion mit den Zellbank- und Fermentationsprozessen (auch als Zellkultur bezeichnet), bei denen ein kleines Volumen einer therapeutisches Protein freisetzenden Zelllinie zu immer größeren Volumina und damit zu immer höheren Zelldichten gepoolt wird. Typische Zelllinien, die in der Biologikaproduktion verwendet werden, sind Säugetier- oder Vogelzellen, können aber auch aus transgenen Pflanzen oder Tieren, Insekten oder Bakterien/ Hefen stammen.

In dem Maße, in dem die anfängliche Arbeits-Zellbank einer Zellkultur/Fermentation unterzogen wird und während des Scale-up in immer größere Bioreaktorgefäße übertragen wird, wird das Risiko einer mikrobiellen Kontamination sowohl wahrscheinlicher als auch kostspieliger. Darüber hinaus ist es gängige Praxis, das Scale-up in einzelnen kleineren Bioreaktoren parallel durchzuführen, die dann in einem größeren Gefäß zusammengeführt werden. Auch hier sind die Auswirkungen einer Verunreinigung hoch, da ein einziges verunreinigtes Gefäß die gesamte gepoolte Charge verunreinigen kann, wenn es nicht entdeckt wird.

Abbildung 1: Darstellung der Herstellung biologischer Zellkulturen.

Diese mikrobiellen Verunreinigungen würden zusammen mit der therapeutischen Zelllinie inkubiert werden. Die mikrobiellen Verunreinigungen können nicht nur das Wachstum der gewünschten Zellen verdrängen und die Gesamtproteinausbeute verringern, sondern auch Toxine und Abfallprodukte freisetzen, die die gesamte Produktionscharge kontaminieren. Da zusätzliche nachgeschaltete Prozesse für kontrollierte Keimbelastungen optimiert sind, sind sie möglicherweise nicht für die Reinigung oder Entfernung hoher Kontaminationslasten optimiert. Für die Hersteller ist es wichtig, Kontaminationen nicht nur zu verhindern, sondern sie auch so früh wie möglich im Herstellungsprozess zu erkennen, um zu verhindern, dass sie eine ganze Charge verderben, was zur Verschwendung von Produkten, Rohstoffen, charakterisierten Zelllinien und zur Reinigung von Anlagen führt.

In der obigen Abbildung werden zunächst mehrere Zellpools zu kleineren Pools zusammengefasst. Dies ist der ideale Kontrollpunkt, um schlechte Pools zu identifizieren, so dass diese aussortiert werden können, bevor sie zu noch größeren Chargen zusammengeführt werden. Leider haben die Hersteller nicht viel Zeit zu warten, und deshalb muss ein mikrobiologischer Screeningtest so schnell wie möglich erfolgen, um die schlechten Zellpools zu finden und zu entfernen und mit der nächsten Prozessstufe fortzufahren.

Einige Biologikahersteller nutzen die ATP-Biolumineszenztechnologie, um die Kontamination von Zellkulturen in Echtzeit zu testen. Eine weitere Bebrütung der Proben ist nicht erforderlich, da die Zellkulturprobe bereits bebrütet wurde, um das Wachstum der Zielzellen zu fördern, die in diesem Fall als Anreicherungsmedium dienen. Die Herausforderung bei diesem Verfahren besteht darin, dass die Proben hohe Mengen an Hintergrund-ATP aus der Zielzelllinie enthalten, und jede ATP-Biolumineszenztechnologie muss erfolgreich mikrobielles ATP von dem in der Probe vorhandenen Hintergrund-ATP unterscheiden können.

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Wenn man über die Grenzen der Möglichkeiten von Tests für mikrobielle Grenzwerte hinausdenkt, ist es wichtig zu verstehen, dass der Nachweis einzelner Zellen nicht das Ziel ist. Nach der Inkubation enthält eine kontaminierte Zelllinie wahrscheinlich ein hohes Maß an mikrobieller Belastung, so dass eine Testempfindlichkeit von etwa 1.000 KBE/ml den Zweck erfüllt, wenn man sie gegen das Risiko abwägt, schlechte Zelllinien nicht in Echtzeit zu entdecken. Doch selbst bei einer Nachweisgrenze von etwa 1.000 KBE/ml muss die ATP-Hintergrundbelastung der Probe noch gemindert werden. Außerdem muss der Test unter Verwendung verschiedener Chargen von Zelllinien wiederholbar sein, damit wir wissen, dass der Test in verschiedenen Situationen und Produktionsmethoden durchführbar sein wird.

Für diese Anwendung analysiert die ATP-Biolumineszenztechnik flüssige Proben, die in eine Küvette gegeben werden. Die folgende Abbildung skizziert den Arbeitsablauf für diese Testmethode. Im Falle der prozessbegleitenden Zelllinien enthält diese Probe eine mikrobielle Kontamination, die mikrobielles ATP enthält. Die Probe enthält auch nicht-mikrobielle Zellen, die ihr eigenes ATP enthalten, sowie freies ATP in der Probe.

Der Zweck der Nachweisreaktion besteht darin, die Produktionszellen zu lysieren und das freie zelluläre ATP zu löschen, während die kontaminierenden Zellen und ihr mikrobielles ATP intakt bleiben. Bei diesem Celsis®-Assay wird den Proben ein Lysereagenz zugesetzt, um dieses Ziel zu erreichen. Anschließend wird freies ATP durch ein ATP-ase-Reagenz hydrolysiert. Nachdem das Hintergrund-ATP aus der Probe entfernt oder reduziert wurde, können herkömmliche ATP-Biolumineszenztechniken angewendet werden, und das Celsis®-Luminometer kann das als Ergebnis der ATP-Biolumineszenzreaktion erzeugte Licht nachweisen.

Abbildung 2: ATP-Biolumineszenz-Assay für prozessinterne Zelllinien.

Die Abbildung zeigt ein Beispiel für Daten, die während Proofof- Concept-Tests generiert wurden, bei denen drei verschiedene Eierntepools, die für die virale Replikation verwendet werden, untersucht wurden, um die Hintergrundwerte der relativen Lichteinheiten (oder Relative Light Units = RLUs) zu verstehen, die erzeugt werden, wenn keine mikrobiellen Verunreinigungen vorhanden sind.

In dieser Studie wurden 30 einzelne Datenpunkte aus jedem der drei Erntepools, die verschiedene Virusstämme enthielten, erzeugt und gemittelt. Diese Werte wurden weiter ausgewertet, um einen geeigneten Grenzwert für künftige Screening-Tests zu bestimmen. Bei jeder Probe, die höhere RLU-Werte als den Grenzwert aufwies, wurde davon ausgegangen, dass sie mikrobielle Verunreinigungen enthielt. Dieser Grenzwert kann auf der Grundlage einer Risikobewertung nach eigenem Ermessen festgelegt werden. Wichtig ist, dass die für den prozessbegleitenden Test gewünschte Methodenempfindlichkeit berücksichtigt wird.

Durchschnittliche RLU

RLU-Basiswert
(2x STD + Mittelwert)

Stamm A

345 533

Stamm B

285 789

Stamm C

433 659

Tabelle 1: Durchschnittliche RLU-Basiswerte, die für Eiernte-Pools festgelegt wurden.

Nachdem die Grundlinien festgelegt wurden, wurden die übrigen Eierntepools mit der beschriebenen ATP-Biolumineszenztechnik getestet. Zum weiteren Nachweis des Konzepts wurde der abgebildete Stamm mit unterschiedlichen bekannten mikrobiellen Belastungen beimpft und mit ATP-Biolumineszenz getestet, um das Signal-Rausch-Verhältnis für kontaminierte Proben zu demonstrieren. Die Proof-of-Concept-Tests zeigten, dass bei dieser Charge eine mikrobielle Belastung von mehr als 1.000 KBE anhand des zuvor festgelegten Grenzwerts "pass/ fail" leicht zu erkennen ist. Darüber hinaus ist zu erkennen, dass die Daten hochgradig linear sind - je größer die beimpfte Keimbelastung, desto größer sind die gemeldeten RLU-Werte.

Abbildung 3: RLU-Werte für künstlich kontaminierte Eipools.

Bei der Bewertung weiterer Stämme wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet. Man kann die Ergebnisse für einen zweiten und dritten untersuchten Stamm sehen. Auch hier sind die Daten hochgradig linear und korrelieren stark mit den Inokulumniveaus, wobei ein signifikanter Unterschied zwischen den etablierten Basisproben und den inokulierten Proben besteht.

Das nachstehende zusammengesetzte Diagramm bietet eine weitere Veranschaulichung der Wiederholbarkeit dieser Methode für die verschiedenen Virusstämme, indem es Grundlinien und Werte für geimpfte "allantoic egg"-Erntepools zeigt. Letztendlich zeigen die Daten, dass diese Echtzeit-Screening- Technologie dazu verwendet werden kann, gepoolte "allantoic" Ernteflüssigkeit und gepoolte Zellkultur-Ernten zu identifizieren, die ein hohes Maß an mikrobieller Kontamination enthalten. Dies verhindert Probleme in nachgeschalteten Filtrationsprozessen und minimiert das Risiko, dass ganze Chargen bei der Biologikaproduktion verworfen werden.

Abbildung 4: Zusammengesetztes Diagramm für RLU-Werte für künstlich kontaminierte Zelllinien.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse bei verschiedenen Virusstämmen in hohem Maße wiederholbar waren. Obwohl die Sensitivität der Assays hoch war und zwischen 1x103 und 1x104 KBE/ml lag, waren die Signal-Rausch- Verhältnisse oberhalb des Pass-Fail-Cutoffs ausreichend signifikant, um eine hohe Zuverlässigkeit des Assays bei diesen Inokulumniveaus zu gewährleisten. In Gesprächen mit Kunden stellte Charles River fest, dass diese Methodik erfolgreich für die prozessbegleitende Prüfung von Vogeleier-Erntepools, insbesondere für Allantoisflüssigkeitspools, eingesetzt wird.

Die Verwendung der ATP-Biolumineszenz-Technologie zum Testen gepoolter biologischer Proben bei hoher Empfindlichkeit der Methode ist ein guter Anfang. Tatsächlich konnten die Wissenschaftler von Charles River in Zusammenarbeit mit Zellherstellern eine Testmethode entwickeln, die den ATP-Hintergrund reduziert, so dass mikrobielle Verunreinigungen leicht aufgespürt werden können. Im größeren Kontext des Bedarfs an medizinischen Therapien ist eine Testmethode, die Kontaminationsniveaus von mehr als 3 Logs nachweist, jedoch sicherlich nicht ausreichend. Ziel ist es, eine Testmethode zu entwickeln, die eine Sensitivität aufweist, die derjenigen des offiziellen Sterilitätstests entspricht oder nahe kommt.

Schnelle Sterilitätstests von zellhaltigen Proben

Wenn es um Sterilitätstests für Fertigprodukte geht, sind die Erwartungen viel strenger, wie viele Fachleute in der Branche wissen. Obwohl neuere Richtlinien wie das kürzlich veröffentlichte USP-Kapitel <1071> einen risikobasierten Ansatz zulassen, ist es immer noch ideal, die Testempfindlichkeit des kompendialen Sterilitätstests zu erreichen und gleichzeitig ein schnelles Ergebnis zu liefern. Um dies zu erreichen, müssen die ATP-Hintergrundwerte weiter reduziert werden, ohne das Signal des mikrobiellen ATP zu verringern.

Zu diesem Zweck hat Charles River einen neuen ATP-Biolumineszenz- Assay namens Celsis Adapt™ Cell entwickelt. Dieser neue Assay umfasst einige zusätzliche Schritte, die den ATPHintergrund weiter reduzieren und die Empfindlichkeit der Methode erheblich senken. Der erste Schritt des Assays besteht in der Anreicherung und Inkubation, wie sie für den herkömmlichen Sterilitätstest vorgeschrieben sind. Die Testprobe wird in der Regel zu etwa 100 ml tryptischer Sojabouillon (TSB) und flüssigem Thioglykollat (FTM) gegeben. Sie wird dann 3-7 Tage lang bebrütet. Anschließend wird eine Probe des Mediums entnommen und einer Behandlungslösung zugesetzt, um die Lysierung der zellulären Komponente der Probe zu unterstützen, während die mikrobiellen Zellen intakt bleiben. Anschließend wird eine physikalische Behandlung mit einem Celsis Adapt™- Probenkonzentrator durchgeführt, gefolgt von der Anwendung eines Apyrase-Reagenzes, das zur Optimierung des mikrobiellen Nachweises leicht modifiziert wurde. Abschließend wird der Celsis® ATP-Assay zum Screening auf mikrobielle Verunreinigungen durchgeführt. Durch die Hinzufügung dieser Verfahrensverbesserungen werden der Probenhintergrund und die Abtrennung des Signals von mikrobiellem ATP im Vergleich zum In-Process-Test weiter reduziert.

Abbildung 5 zeigt einen Vergleich der verschiedenen getesteten ATP-Biolumineszenz-Assays. Die erste Gruppe von Balkendiagrammen stellt Proben dar, die mit einem amplifizierten ATP-Biolumineszenz- Assay getestet wurden, ohne die zuvor beschriebenen zellulären Behandlungsschritte. Negative Medienkontrollen sind in Blau und Orange dargestellt und zeigen RLU-Werte von etwa 1000 RLU. Wurden den Medien zellhaltige Proben (in diesem Beispiel CHO-Zellen) zugesetzt, lagen die RLU-Werte bei über 100.000 RLU. Sicherlich wäre mikrobielles ATP in einer auf diese Weise getesteten Probe nicht zu erkennen.

Als ein Apyrase-Reagenz hinzugefügt wurde, änderten sich die Testergebnisse für diese Zelllinie nicht dramatisch. Die Signale der Medien-Negativkontrolle verringerten sich sogar leicht, aber das Probensignal schien nicht verringert zu werden. Als schließlich die zusätzliche optimierte Zellbehandlung angewendet wurde, kam es zu einem dramatischen Rückgang der RLU von zellulärem ATP in der Probe. Es gab zwar einen gewissen Anstieg der RLU, aber der drastische Rückgang ermöglichte es dem Test, mikrobielles ATP zu erkennen, wenn es in Mengen vorhanden war, die über dem Grundlinienrauschen der Probe lagen.

Abbildung 5: Hintergrund von 10%igen Zellproben mit verschiedenen Behandlungen.

In der Studie wurde dann die Fähigkeit des Assays bewertet, mikrobielles ATP zu erkennen, wenn der optimierte Zelltest durchgeführt wird. Die Ergebnisse sind in Abbildung 6 dargestellt. Für diese Testreihe untersuchte Charles River einige verschiedene Mikroorganismen, einschließlich Pilzarten, unter Berücksichtigung unterschiedlicher Inkubationstemperaturen oder sogar Medien, um die neue Testmethode besser zu charakterisieren. Jeder Balken in der Grafik steht für jeden weiteren Tag, an dem das bebrütete Medium mit dem Celsis® ATP-Assay gemessen wurde. Immer, wenn zwei aufeinanderfolgende positive Assays gemessen wurden, wurde die Inkubation für diesen Mikroorganismus beendet.

Bei der Auswertung von Bacillus subtilis ist zu erkennen, dass B. subtilis eine Inkubation bei 35 °C gegenüber 25 °C bevorzugt, da B. subtilis nach nur einem Tag Inkubation bei 35 °C und nach zwei Tagen bei 25 °C nachgewiesen wurde. Wie in Abbildung 6 dargestellt, wird Aspergillus brasiliensis mit dem neuen Zelltest ebenfalls in nur drei Tagen erfolgreich nachgewiesen. Schließlich wurde in der Studie ein langsam wachsender Keim, Cutibacterium acnes, untersucht, da er bekanntermaßen eine der größten Herausforderungen für ATP-Biolumineszenz-Assays darstellt.

Abbildung 6: Zeit bis zum Nachweis.

Für diesen Test wurde ein willkürlicher Cutoff-Wert von 5000 RLU festgelegt, da die Hintergründe der verschiedenen Zelltypen noch nicht vollständig charakterisiert worden sind. Die Er Ergebnisse des Diagramms, das Tests ohne Produkt darstellt, zeigen, dass mikrobielle Kulturen von < 10 KBE alle in etwa drei Tagen positive Ergebnisse lieferten.

Nach der Demonstration eines Assays, der zelluläres ATP reduziert und den Nachweis von mikrobiellem ATP ermöglicht, führte Charles River Tests in Gegenwart von beidem durch, um die Anwendung der verbesserten Methodik weiter zu demonstrieren. Für die folgenden Experimente wurden zwei Zelllinien ausgewählt, die als "Zelllinie 1" und "Zelllinie 2" bezeichnet werden. Wie bereits erwähnt, erfordert der neue Assay einen Anreicherungs- und Inkubationsschritt, im Gegensatz zu dem zuvor besprochenen In-Process-Assay. Es wurde die bereits bestehende Methode des Compendial-Assays verwendet, aber anstatt die visuelle Trübung zu überprüfen, wurde der neue Celsis® - Assay zur Bestimmung der Ergebnisse verwendet. In diesem Fall wurden die TSB- und FTM-Medien direkt beimpft, wie es bei zellbasierten Präparaten häufig der Fall ist, da sich die Membranfiltration in der Vergangenheit als problematisch erwiesen hat.

In diesem Beispiel wurden zwei Zelllinien mit zwei direkten Inokulationsmethoden getestet, wobei die Konzentration der Zellen pro Volumen des Mediums bei Methode 2 (in rot) höher war als bei Methode 1 (in blau).

Beachten Sie, dass die Diagramme in Abbildung 7 auf einer logarithmischen Skala beruhen. Die Medienkontrollen meldeten RLU-Werte im Bereich von zwei Logs (128 RLU), die Zellproben selbst im Bereich von etwa drei. Bei einer Inokulation mit Staphylococcus aureus vor der Inkubation wurden am Ende der Inkubation deutlich erhöhte RLU-Werte im Bereich von sechs oder sogar sieben Logs festgestellt.

Abbildung 7: Mikrobielle Rückgewinnung aus Zellproben in FTM.

Das Entscheidende an den Daten ist der Unterschied zwischen den RLU-Werten, die für nicht kontaminierte Zellproben im Vergleich zu den mit einem geringen Gehalt an Mikroorganismen kontaminierten Proben gemeldet werden. Das Signal-Rausch- Verhältnis zeigt, dass bei einer Inokulation mit nur 38 KBE S. aureus die Ergebnisse für die Zelllinie 1 im Durchschnitt 23.000 Mal höher waren als die Kontrollen und die Ergebnisse für die Zelllinie 2 1.900 Mal höher als die Kontrollen. Man sollte bedenken, dass selbst ein logarithmischer Anstieg des RLU-Wertes als signifikant angesehen wird, wenn es darum geht, eine mikrobielle Kontamination vom Hintergrundsignal zu unterscheiden. Ähnliche Werte wurden auch für Clostridium sporogenes gemeldet. Als letztes Beispiel für diese Studie zeigt Abbildung 8 die Ergebnisse von Tests, die mit dem Mikroorganismus A. brasiliensis durchgeführt wurden. Die Schnellmethoden zum Nachweis von Schimmelpilzen unterliegen einigen allgemein bekannten Einschränkungen. In dieser Studie führte diese überarbeitete Methode der Zellapplikation zu erheblichen Verbesserungen beim Schimmelpilznachweis im Vergleich zu anderen nicht- ATP-basierten Schnellmethoden.

Abbildung 8: Mikrobielle Wiederherstellung von Zellproben in TSB.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse des Celsis Adapt™ Cell Assay zeigen, dass der Assay bei niedrigen mikrobiellen Konzentrationen, insbesondere bei Verwendung von Inokulum von weniger als 100 KBE oder sogar 10 KBE, mikrobielle Verunreinigungen in weniger als der Hälfte der Zeit eines herkömmlichen Sterilitätstests nachweisen kann.

Das hohe Signal-Rausch-Verhältnis zeigt, dass selbst bei niedrigen Werten ein hoher Trennwert besteht, der die Interpretation eines positiven Ergebnisses von einem negativen in nur wenigen Tagen ermöglicht. Darüber hinaus haben die Tests gezeigt, dass der ATP-Assay gleichermaßen in der Lage ist, Bakterien- und Pilzarten nachzuweisen.

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Nach dem Erfolg dieser Tests mit den in diesem Artikel beschriebenen Zelllinien hat Charles River viele verschiedene zusätzliche Zelllinien erhalten und getestet, mit anhaltendem Erfolg bei über 20 Zelllinien. Die Daten belegen weiterhin die breite Anwendbarkeit des Assays, und es sind bisher noch keine problematischen oder inkompatiblen Zelllinien aufgetreten.

Die größte Herausforderung bei der Entwicklung eines adäquaten Sterilitätstests ist die Überwindung der Inhibition, die selbst für einen herkömmlichen Sterilitätstest ein Problem darstellt. Dies zeigt, dass unser ATP-Biolumineszenztest mikrobielle Verunreinigungen nachweisen kann, wenn sie vorhanden sind und nicht durch die Probe gehemmt werden.

 

Autorin:
Stacey Ramsey
... leitet derzeit das Labor für technische Dienstleistungen und Validierungen von Celsis® in Charleston, SC. Sie kam ursprünglich als Associate Product Manager zu Charles River und verfügt über mehr als 15 Jahre Erfahrung in der pharmazeutischen Industrie, insbesondere in den Bereichen Umweltüberwachung, Arzneimittelprüfungen, Endotoxintests sowie Prozess- und Methodenentwicklung und -validierung.

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