Effiziente und zuverlässige Keimidentifizierung mittels MALDI-ToF-MS
Einleitung
"Fundiertes Wissen ist ein wesentlicher Schritt zum Erfolg" - insbesondere im pharmazeutisch-mikrobiologischen Bereich. Eine präzise Identifizierung von Mikroorganismen bildet die Grundlage für viele entscheidende Prozesse: Sie ist ein zentraler Bestandteil der Qualitätssicherung im Pharma- und Lebensmittelbereich, unterstützt die Differenzierung zwischen harmlosen und pathogenen Mikroorganismen und ermöglicht eine gezielte Antibiotika-Therapie. Daher ist eine artgenaue Identifizierung auf Speziesebene von großer Bedeutung. Eine leistungsfähige Methode hierfür ist die Keimidentifizierung mittels Maldi-ToF-Massenspektrometrie (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight). Diese präzise Technologie ermöglicht es, Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten zu identifizieren. Während die Identifizierung von optimal kultivierten Referenzstämmen in der Regel problemlos gelingt, stellt sich in der Praxis jedoch eine wichtige Frage: Wie zuverlässig lassen sich Feldstämme identifizieren, die beispielsweise durch Desinfektionsmittel oder andere Umwelteinflüsse vorgeschädigt wurden?
Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurde in Zusammenarbeit mit bioMérieux und der Labor LS SE & Co. KG, einem der führenden Auftragslabore für mikrobiologische und physikalisch-chemische Prüfungen in der Pharma-, Medizintechnik- und Kosmetikindustrie, eine Studie zur Keimidentifizierung mittels Maldi-ToF durchgeführt. Im nachfolgenden Beitrag werden Aufbau, Durchführung und Ergebnisse der Studie sowie die daraus abgeleiteten Schlussfolgerungen vorgestellt.
Studienaufbau/Durchführung
Die Studie wurde in zwei Phasen unterteilt, welche nacheinander durchgeführt wurden.
In Phase 1 wurden über einen Zeitraum von mehreren Wochen 400 Isolatstämme zufällig aus Routineproben ausgewählt. Um ein möglichst breites Keimspektrum zu erfassen, wurde darauf geachtet, dass sich die Stämme hinsichtlich ihrer Herkunft, Koloniemorphologie (z. B. Farbe und Form) sowie des jeweiligen Probenmaterials möglichst stark unterscheiden. Zur weiteren Untersuchung wurden die Bakterien zunächst auf Columbia-Blut-Agar und/oder R2A-Agar subkultiviert, Hefen auf SDA-Agar und Schimmelpilze auf Malzextrakt-Agar sowie ebenfalls auf SDA-Agar. Anschließend erfolgte die Identifizierung mittels Maldi-ToF-Methode im Dreifachansatz mit dem VITEK® MS PRIME.
Die Probenaufbereitung unterschied sich je nach Mikroorganismengruppe. Bei Bakterien wurde das Keimmaterial direkt auf die Targetspots übertragen und mit Matrix (VITEK® MS CHCA - alpha-Cyano-4-Hydroxy-Cinnamic Acid) überschichtet. Hefen wurden gemäß den Herstellervorgaben zunächst mit Ameisensäure (VITEK® MS-FA - Formic Acid) behandelt und anschließend ebenfalls mit Matrix versetzt. Für die Analyse von Schimmelpilzen kam das VITEK® MS Mould-Kit zum Einsatz, das Ethanol, Ameisensäure und Acetonitril enthält. Durch mehrere Wasch- und Zentrifugationsschritte wurden die Proteine aus Sporen und Myzel extrahiert und im Flüssigkeitsüberstand angereichert. Dieser Überstand wurde anschließend auf die Targetspots pipettiert und abschließend mit Matrix überschichtet.
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Die Ergebnisse aus dem System wurden einer umfangreichen Plausibilitätsprüfung unterzogen: Jedes Ergebnis aus dem System wurde mit der vorliegenden Kulturmorphologie und dem mikroskopischen Bild (Gramfärbung bzw. Fruchtkörper) verglichen und anschließend tabellarisch erfasst, um für die spätere Auswertung zur Verfügung zu stehen. Die nachfolgende Tabelle zeigt einen exemplarischen Ausschnitt aus der Ergebnistabelle.
In Phase 2 standen die Schimmelpilze im Fokus. Hier wurden die Ergebnisse der Schimmelpilzidentifizierungen aus dem VITEK® MS PRIME mit denen der molekularbiologischen Identifizierung durch den MicroSEQ™ ID verglichen (geprüft wurde die 28S-rDNA Region), um herauszufinden, ob die Maldi-ToF-Methode eine gute Alternative zur herkömmlichen Schimmelpilzdiagnostik bietet.
Aus Phase 1 konnten aus den 40 ausgewählten Schimmelpilzisolaten insgesamt 36 erfolgreich und plausibel identifiziert werden. Aus diesen ergaben sich 27 unterschiedliche Schimmelpilz-Spezies. Zusätzlich zu den vier nicht identifizierbaren Isolaten wurden nun 31 Sequenzierungen durchgeführt.
Die generierten Sequenzen der 28S-rDNA Region wurden anschließend mit Hilfe der MicroSEQ™ ID Datenbank und der NCBI-Datenbank ausgewertet. Die daraus resultierenden Ergebnisse wurden dann mit denen der Maldi-ToF-Methode verglichen.
Tab. 1: Beispiel zur tabellarischen Ergebnisdokumentation mit Ergebnis und Konfidenzlevel
Ergebnisse
Phase 1: Um die Ergebnisse aus Phase 1 zusammenzufassen, wurden zunächst zwei ID-Rates definiert:
Overall-ID Rate: Dabei handelt es sich um alle gemessenen Spots, bei denen eine plausible Speziesidentifizierung durchgeführt werden konnte (insgesamt 400 Isolates im Dreifachansatz entsprechen 1.200 Spots).
Condensed-ID Rate: Dabei handelt es sich um die Rate, bei der mindestens ein Ansatz eines Isolates zu einem plausiblen Speziesergebnis führte und dadurch das Isolat insgesamt bestimmt werden konnte (400 Isolates).
Ein Ergebnis gilt als plausibel, wenn der Konfidenzwert des Ergebnisses mindestens 60% beträgt, mit dem mikroskopischen Bild der Gramfärbung und der Kulturmorphologie konform ist.
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Bei Mehrfachnennungen des Systems ist die Summe des Konfidenzwerts zu beachten und ggf. eine Selektierung der Ergebnisse vorzunehmen.
Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse aller Isolate inklusive der darin enthaltenen Hefen und Schimmelpilze.
Tab. 2: Zusammenfassung der ID-Rates
Aus den insgesamt 400 zufällig ausgewählten Isolaten konnten 84,25 % erfolgreich und plausibel mit dem VITEK® MS Prime auf Speziesebene identifiziert werden und geben einen realen Wert für eine pharmazeutische Industrieumgebung wieder.
Phase 2: Bei der Gegenüberstellung der Schimmelpilzergebnisse von Maldi-ToF-Methode und Sequenzierung wurde bewertet, welches System das eindeutigere Speziesergebnis liefert. Einige Schimmelpilze sind in der VITEK® MS Datenbank als Gruppen oder Komplexe zusammengefasst oder es werden mehrere gleichwertige Nennungen in der Sequenzierung angegeben. Daraus resultierten bei den 31 Isolaten folgende Ergebnisse:
- Maldi-ToF lieferte in 13 Fällen ein eindeutigeres Ergebnis
- In 14 Fällen waren die Ergebnisse zwischen Maldi-ToF MS und Sequenzierung gleichwertig
- In 4 Fällen lieferte die Sequenzierung ein eindeutigeres Ergebnis, davon können 3 Fälle auf fehlende VITEK MS Datenbankeinträge zurückgeführt werden
Fazit
Die Identifizierung mittels Massenspektrometrie bietet eine hohe Zuverlässigkeit und Leistungsfähigkeit für die Identifizierung von Mikroorganismen auf Speziesebene in der pharmazeutischen Qualitätskontrolle. Von 400 pharmazeutisch relevanten Keimen aus typischen Umgebungsbedingungen konnten 84,25 % zuverlässig auf Speziesebene identifiziert werden.
Bei der Schimmelpilzidentifizierung bietet diese Methode im Vergleich zur 28S-rDNA Sequenzierung nicht nur in Bezug auf die Genauigkeit der Ergebnisse bessere Resultate. Durch die schnellere Durchlaufzeit und die einfachere Probenaufbereitung eignet sie sich ideal für den routinemäßigen industriellen Einsatz.
Die Identifizierung von Mikroorganismen auf Speziesebene ist eine wichtige Anforderung für Qualitätskontrolluntersuchungen, dies findet sich nicht zuletzt auch im Rahmen der Contamination Control Strategy des Annex 1.
Die Identifizierung auf Gattungsebene reicht nicht mehr aus, wenn Monitoringergebnisse Überschreitungen zeigen oder in kritischen Bereichen, wie beispielsweise in der Sterilfertigung, Mikroorganismen detektiert werden.
Die Maldi-ToF-Technologie zur Keimidentifizierung ist für die Pharma-, Medizintechnik- und Lebensmittelindustrie unerlässlich.
Über die Autoren:
Melanie Braun ... ist als Leitung der mikrobiologischen Dienstleistungen bei der Labor LS SE & Co. KG und zuständig für die Gebiete Keimidentifizierung, Betriebshygiene inkl. On-Site-Services, Stammkeimhaltung und Growth Promotion Tests. Sie fungiert als Lektorin für die webbasierte mikrobiologische Enzyklopädie LS-pedia und ist neben den verschiedenen Fachgebieten für Qualifizierungs- Dienstleistungen und für die Implementierung der Contamination Control Strategy bei LS zuständig.
Marius Pfister ... ist nach seinem Bioanalytikstudium an der Hochschule für angewandte Wissenschaften in Coburg seit 2021 bei Labor LS SE & Co. KG als Fachleiter im Bereich der Keimidentifizierung tätig. Zu seinen Aufgaben zählt u.a. der enge Kundensupport bei Fragen zur Keimidentifizierung, Qualifizierung von Geräten und Freigabe von Testberichten.
