Bioburden - Fragen und Antworten zur biopharmazeutischen Herstellung.
Die Bioburden-Kontrolle spielt in verschiedenen Bereichen der pharmazeutischen bzw. biopharmazeutischen Herstellung und Qualitätskontrolle eine Rolle. Zum einen durch das Kapitel <1115> "Bioburden Control of Nonsterile Drug Substances and Products" der USP, das dieses Thema Bioburden in den Fokus der Arzneimittelhersteller nimmt und Schwerpunkte bei der Kontrolle der mikrobiellen Populationen während des gesamten Produktionszyklus von Hilfsstoffen, Wirkstoffen und Fertigarzneimitteln hat.
Zum anderen ist "Bioburden" auch ein Thema der sterilen Herstellung. Der im August 2023 inkrafttretende neue Annex 1 des europäischen GMP-Leitfadens fordert: "10.3 Der Bioburden-Test sollte bei jeder Charge sowohl für aseptisch abgefüllte als auch für endsterilisierte Produkte durchgeführt werden, und die Ergebnisse sollten im Rahmen der abschließenden Chargenprüfung berücksichtigt werden. Unmittelbar vor dem Sterilisationsfilter oder dem abschließenden Sterilisationsverfahren sollten Grenzwerte für die Keimbelastung festgelegt werden, die sich auf die Effizienz des anzuwendenden Verfahrens beziehen. Die Proben sollten so entnommen werden, dass sie für das Worst- Case-Szenario repräsentativ sind (z. B. am Ende der Haltezeit). Wenn für terminal sterilisierte Produkte Overkill-Sterilisationsparameter festgelegt werden, sollte die Keimbelastung in geeigneten Zeitabständen überwacht werden" (Üb. d. Red.)
Außerdem wird die Bioburdenprüfung für Medizinprodukte, die in den USA hergestellt oder verwendet werden, durch Titel 21 des Code of Federal Regulations und weltweit durch ISO 11737 geregelt.
Hintergrund
Darauf basierend hatte die ECA Academy dieses Thema in einer speziellen Workshop-Sitzung aufgegriffen, um es aus verschiedenen Blickwinkeln zu betrachten und Informationen über den rechtlichen Hintergrund sowie praktische Beispiele und Strategien für die Bioburden-Kontrolle zu liefern. Pharmakopöe- Experten, Vertreter der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Prüflaboratorien stellten die wichtigsten Informationen zusammen und zeigten die Herausforderungen der Bioburden-Kontrollstrategie und die Umsetzung einer angemessenen Kontrolle in Unternehmen auf.
Dieser Beitrag enthält alle Fragen, die während des "Bioburden"- Workshops nach den folgenden vier Vorträgen von Sven Deutschmann (Roche) und Sebastian Thoelken (Novartis) über die biopharmazeutische Herstellung eingegangen sind:
• Bioburden-Tests - Richtlinien und Vorschriften
• Mikrobielle Kontrollstrategie für die biopharmazeutische Produktion
• Bioburden für Sterilbetriebe
• Bewertung von Bioburden-Exkursionen in nicht sterilen biologischen Herstellungsprozessen
1. Mikrobielles Kontrollsystem
Fragen:
(i) "Was ist die untere Spezifikation für einen Bioburden? Ist ein Bioburden mit einer Spezifikation von weniger als 1 realistisch? (aufgrund der Umgebung, der Verbrauchsmaterialien und der Ausrüstung des Tests)? Was sollte also die untere Spezifikation sein? Weniger als 3? Weniger als 5?"
(ii) "Bezüglich der Grenzwerte für die Keimbelastung: Proben aus der Drug Substance-Produktion in den Klassen D, C und B werden aseptisch entnommen und in einem nicht klassifizierten mikrobiologischen Labor analysiert. Gelegentlich können ein paar Kolonien auf den Platten wachsen, die als Sekundärkontamination von der Probenahme oder der Handhabung herrühren. Ist es in diesem Fall sinnvoll, einen Grenzwert für die Keimbelastung von <1 KBE/10 mL festzulegen, oder was würden Sie empfehlen?
Antwort: Es wird eine stufenweise Abstufung der Grenzwerte festgelegt. Engere Grenzwerte werden näher am Ende des Prozesses mit ≤ 10 KBE/10 mL festgelegt, wenn die Drug Substance/der Wirkstoff eingefroren wird.
Fragen:
(i) "Haben Sie für jede definierte Probenahmestelle einen Eignungstest für die Bioburdenmethode durchgeführt? Oder haben Sie einen Ansatz gewählt, der auf einer Worst- Case-Probe basiert (Wahrscheinlichkeit, dass das Zwischenprodukt / der Puffer den Test stört), um einige andere Schritte abzudecken und den Aufwand für die Methodeneignungsprüfung auf der Grundlage einer Risikobewertung zu verringern?"
(ii) "Behörden und Inspektoren - inwieweit erwarten sie eine Überwachung der Kontrolle der Keimbelastung im gesamten Prozess und ist dies alles risikobasiert?"
Antwort: Ja, für jede definierte Probenahmestelle wird ein Methodeneignungstest durchgeführt. Bei der Festlegung der Probenahmestellen wird ein risikobasierter Ansatz verwendet, bei dem u. a. Folgendes berücksichtigt wird: (i) die Konfiguration der Prozessausrüstung, einschließlich der Platzierung von Filtern zur Reduzierung der mikrobiologischen Belastung, um mögliche blinde Flecken bei der Erkennung von Verunreinigungen zu vermeiden, oder (ii) offene Verarbeitungsschritte und die umgebende Umgebung oder (iii) die potenziellen Auswirkungen von Konditionierungsschritten (z. B. extreme pH-Einstellungen oder Zugabe von Säuren oder Detergenzien) zur Inaktivierung potentieller virologischen Belastungen oder (iv) die wachstumsfördernde Fähigkeit des Prozesspools.
Frage: "Sollten Puffer, die steril gefiltert angeliefert werden, vor der Verwendung in der Produktion auf Bioburden getestet werden? Oft wird doch bereits auf Endotoxine getestet."
Antwort: Es gibt keine Spezifikationen oder Vorgaben, die dies vorschreiben. Wenn die Sterilität des Puffers aber zwingend vorgeschrieben ist, dann sollte dies auch durch Zertifikate oder Tests nachgewiesen werden.
Fragen:
(i) "Sollte es Warngrenzen für alle Bioburden In-Prozess- Kontrollen (IPCs) aus der aseptischen Produktion geben?"
(ii) "Empfehlen Sie für die aseptische Produktion in Reinräumen der Klasse C-D weiterhin Aktionsgrenzen (AG) für alle IPC-Schritte? Oder sind Warngrenzen (WG) für IPC-Schritte nur bei aseptischer Produktion in Klasse A-B erforderlich?"
Antwort: (i) Ja. (II) Es sind AG und WG für alle IPC-Stufen erforderlich.
Frage: "Können Prozesse der pH-Behandlung des Pools (wie die Virusinaktivierung) das Vorhandensein von Bioburden oder Endotoxinen darin verschleiern? Ich meine, ist es möglich, dass Bioburden in der Bioburden-Analyse in einer Probe des Pools vor der Durchführung der viralen Inaktivierung aber nicht nach der Beendigung der viralen Inaktivierung nachgewiesen wird?"
Antwort: Ja - die potenziellen Auswirkungen von Konditionierungsschritten (z. B. extreme pH-Einstellungen oder Zugabe von Lösungsmitteln/Detergenzien) auf die potenzielle Inaktivierung mutmaßlicher Keime müssen bei der Festlegung der Probenahmestellen berücksichtigt werden.
Frage: "Nehmen Sie immer Proben und testen Sie auf Endotoxine parallel zu Bioburden? Wenn nicht, warum?" (Anmerkung: ausdrückliche Frage an den Kollegen von Novartis zu desssen Vortrag zur Drug Product-Herstellung)
Antwort: In den meisten Fällen werden beide IPCs parallel bemustert (eine Ausnahme kann zum Beispiel der Ausschluss eines "Low Endotoxin Recovery"-Effekts (Maskierung von Endotoxinen durch z. B. spezielle Pufferkompositionen) sein, durch den die Notwendigkeit für eine parallele Testung auf Endotoxine in bestimmten Prozessabschnitten ggf. nicht mehr gegeben ist). Anmerkung: In der EMA-Leitlinie für die Sterilisation von Arzneimitteln, Wirk- und Hilfsstoffen und Primärbehältnissen wird nicht gefordert, vor der Sterilfiltration auf Endotoxine zu testen. Es wird lediglich eine Bioburden-Kontrolle verlangt. Das basiert auf den Erfahrungen bei Audits und Inspektionen. Die FDA erwartet die Endotoxinprüfung parallel zu BB1.
Frage: "Wenn Warn- und Aktionsgrenzen für alle IPC-Schritte erforderlich sind, gilt dies dann für alle Produktphasen (Phase I-III, PPQ und kommerziell)? Und wie legt man diese Grenzen für die Phasen I-III und PPQ fest, wenn nur eine geringe Anzahl von Chargen produziert wurde?"
Antwort: Ja. Vorläufige Grenzwerte werden während der Entwicklung verwendet, bis genügend historische Daten vorliegen. Alternativ können für Produkte, die nur selten hergestellt werden (z. B. in der Entwicklung), Daten aus ähnlichen Verfahren verwendet werden.
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Frage: "Da im Rahmen der Drug Product-Produktion die Bioburden-Probe vor der Sterilisation durch Filtration entnommen wird, ist das Produkt noch nicht steril, so dass einige Inspektoren wollen, dass wir alle Erwartungen anwenden, die eher auf biologische Drug Substance/Wirkstoffe anwendbar sind. Ist dies relevant? Was würden Sie empfehlen?"
Antwort: Die Philosophie des schrittweisen Absenkens der Grenzwerte sollte auch für die Herstellung von Drug Product gelten. Generell sollten die für die Herstellung von Arzneimitteln geltenden Grenzwerte nicht weniger streng sein als die für Arzneimittelwirkstoffe festgelegten Grenzwerte. Schrittweises Absenken der Grenzwerte.
Frage: "Wie sieht es mit den Auswirkungen der biologischen Belastung (und ihrer Nebenprodukte) auf gebrauchte Produktionsanlagen aus? Gibt es im Falle einer mikrobiellen Belastung eine Richtlinie/Rationale, um die Sicherheit von Harzen/Filtrationsmembranen für die Wiederverwendung im Herstellungsprozess zu bewerten? Wenn es sich um eine nicht zählbare Keimbelastung (too numerous to count - TNTC) handelt und keine Berechnungen durchgeführt werden können, gibt es dann eine Möglichkeit (z. B. eine Art Leerlaufstudie), um zu gewährleisten, dass dieses Nebenprodukt keine Auswirkungen hat?"
Antwort: Die Reinigungs- und Desinfektionsverfahren sollten streng genug sein, um Verunreinigungen und etwaige Nebenprodukte zu entfernen. Die Wirksamkeit der Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen muss in einer Reinigungsvalidierung nachgewiesen werden und eine Überwachung der Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen muss in der Routine etabliert werden.
Frage: "Ist es wichtig, Haltezeiten für jeden Prozessschritt zu definieren? Oder ist aus mikrobiologischer Sicht die Gesamthaltezeit (alle Prozessschritte bis zum Beginn der Sterilisation) entscheidend?"
Antwort: Ja. Es muss eine maximale Haltezeit für jeden Prozessschritt definiert und validiert (Validierung bei >24H) werden.
Frage: "Sie haben Kontrollen zur Beurteilung des Kontaminationsrisikos für Hersteller von pharmazeutischen Inhaltsstoffen und Wirkstoffen beschrieben. Gibt es Ihres Wissens nach eine Vorschrift zur Umgebungskontrolle von Betrieben, die Wirkstoffe oder Ausgangsstoffe herstellen, welche für die Herstellung von nicht sterilen Arzneimitteln (trockene Formen) verwendet werden sollen?"
Antwort: Wenn für die Produktion eine Hygienezone festgelegt ist, in der die Herstellung erfolgen soll, dann müssen die Anforderungen an diese Hygienezone erfüllt werden.
2. Herstellung von Drug Substances
Frage: "Ist ein anaerober Bioburden-Test in einem der Herstellungsschritte, z. B. in der Zellkultur, erforderlich oder wird er von der FDA erwartet?"
Antwort: Ja, die FDA verlangt einen Test auf anaerobe Keimbelastung am Ende des Säugetierzellkulturprozesses.
Frage: "Wurde das Säugetierzellkulturmedium in der finalen Bulkware des Produkts verwendet?"
Antwort: Nein. Bei CHO-basierten Expressionssystemen wird das Produkt in den Überstand freigesetzt. Der Überstand wird gereinigt. Daher ist das Zellkulturmedium im Endprodukt nicht mehr enthalten.
Frage: "Welches ist die empfohlene Methode für Vorkultur- Ernteproben zum mikrobiellen Nachweis, Filtrationsmethode oder Flüssigmedium als TSB?"
Antwort: Das hängt von der Spezifikation für die Ernteproben ab. Wenn die "Abwesenheit jeglicher mikrobieller Kontamination" definiert ist, könnte eine qualitative Methode wie die direkte Inokulation verwendet werden. Ist ein Grenzwert für die Keimbelastung definiert (z. B. ≤ 10 KBE/10 ml), so muss eine quantitative Methode verwendet werden. Aufgrund des im Beispiel festgelegten Testvolumens ist nur die Membranfiltrationsmethode anwendbar.
Frage: "Bezüglich der Vorfiltrationsproben des Säuleneluats: Die Elutionsphase ist in der Regel nicht während der gesamten Phase konstant. Normalerweise wird ein hoher Peak an konzentriertem Produkt in der ersten Sequenz der Elution herausgelöst, während die Konzentration des Produkts abnimmt, wenn sich das Ende der Phase nähert. Welcher Zeitpunkt sollte beprobt werden und wie können wir sicherstellen, dass dies repräsentativ für die gesamte Phase ist?"
Antwort: Die Keimbelastung in der entsprechenden Sequenz, die für die weitere Verarbeitung verwendet wird, sollte getestet werden.
3. Herstellung von Arzneimitteln/Endprodukten
Fragen:
(i) "In der EMA-Leitlinie zur Sterilisation des Arzneimittels, des Wirkstoffs, des Hilfsstoffs und der Primärverpackung (6. März 2019) heißt es: "In den meisten Situationen wäre ein Grenzwert von NMT 10 KBE/100 ml (TAMC) für die Bioburden- Prüfung akzeptabel". Sind 100 ml aus Ihrer Sicht also das Mindestvolumen, welches zu filtern ist? Und haben Sie Erfahrungen mit den Erwartungen der FDA hinsichtlich des Mindestvolumens für das zu filternde Produkt?"
(ii) "Was ist ein angemessener Grenzwert für die Keimbelastung vor der Sterilisation einer kleinvolumigen pharmazeutischen Lösung? In den Leitlinien wird ein Wert von 100 cfu/100 ml vorgeschlagen, aber wenn die gesamte Charge nur aus einem Fläschchen mit 20 ml besteht, würde dies 2 cfu pro Fläschchen bedeuten, also fast steril. 100 cfu/100 ml sind nicht sinnvoll, aber welche anderen Grenzwerte können gerechtfertigt sein?"
(iii) "Liegt die Spezifikation/Akzeptanzgrenze bei 10 KBE/100 ml?"
Antwort: Es wird ein Probenvolumen von 100 ml erwartet. Jede Abweichung von diesem Probenvolumen muss begründet und von der zuständigen Gesundheitsbehörde akzeptiert werden. Im Allgemeinen kann kein "Mindestvolumen" festgelegt werden. Es ist immer eine Einzelfallbetrachtung, bei der u. a. die Chargengröße bestimmend ist.
Frage: "Bei endsterilisierten Produkten, bei denen der Herstellungsprozess einen Filtrationsschritt zur Reduzierung der Keimbelastung vor der Sterilisation umfasst: an welcher Stelle des Prozesses sollte die IPC-Keimbelastung beprobt werden? Ist es in Ordnung, die Bioburden nach der Filtration (aber vor der Sterilisation) zu testen? Oder sollte die Keimbelastung bei der Rohware getestet werden (vor der Filtration und Sterilisation)?"
Antwort: Generell gilt die Probenahme vor dem finalen Sterilisationsprozess. Zusätzliche Probenahmestellen können erforderlich sein, wenn der Herstellungsprozess des Arzneimittels weitere Prozessschritte umfasst.
Fragen:
(i) "Wenn Sie eine 10-ml-Probe (IPC oder DS) analysieren, geben Sie das Endergebnis in KBE/10 ml an oder erlauben Sie eine Extrapolation auf 100 ml, um die EMA-Leitlinie zur Sterilisation von Arzneimitteln, Wirkstoffen, Hilfsstoffen und Primärverpackungen (6. März 2019) zu erfüllen?"
(ii) "Spezifikation < 10 CFU/100 ml: wenn wir nur 10 ml zu testen haben, dann finde ich eine Spezifikation < 1 CFU/10 ml nicht angemessen. Der Bioburden-Test, der in einem mikrobiologischen Labor durchgeführt wird, kann eine Spezifikation von < 1 nicht erreichen (Ausrüstung, Prüfumgebung ...)?"
(iii) "Bei kleinen Chargen ist es in Ordnung, ein an einer 10 ml (oder 30 ml) Probe erzieltes Ergebnis auf 100 ml zu extrapolieren. Dies beruht auf der Annahme, dass die Mikrokontamination in einer Probe homogen ist. In den meisten Fällen sind die Keime jedoch in einer Probe gebündelt. Wie rechtfertigen Sie daher Ihren Ansatz?"
(iv) "Was gilt als geringe Chargengröße - maximal 10 Liter - mehr?"
Antwort: Ihre interne Prüfmethode muss die Berichterstattung festlegen. Das Endergebnis könnte in KBE/10 ml oder nach Extrapolation in KBE/100 ml angegeben werden.
Fragen:
(i) "Haben Sie nachgewiesen, dass Ihr Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm Mykoplasmen zurückhalten kann, wenn er zur Sterilisation von Produkten verwendet wird?"
(ii) "Wie haben Sie insbesondere das Kapitel USP<1229.17> über die Sterilisation von Mykoplasmen gehandhabt? Oder planen Sie, auf eine Standardsterilisation mit 0,1 Mikron umzusteigen?"
(iii) "Bioburden vor der Sterilfiltration: Überprüfen Sie die Abwesenheit von Mykoplasmen?"
Antwort: Ja (für das DS-Verfahren) und Nein (für das DP-Verfahren). Normalerweise werden die Anforderungen an den für die endgültige Sterilfiltration verwendeten Filter in Unterabschnitt 4.1.5. "Sterilfiltration" und die im Qualitätsdossier vorzulegenden Filterdaten sind in Tabelle 3 der EMA-Leitlinie zusammengefasst. Die Abwesenheit von Mollicutes wird am Ende des Zellkultur-/USP-Prozesses nachgewiesen, und aseptische Herstellungsbedingungen garantieren, dass während des DSP-Prozesses keine Mollicutes- Kontaminationen auftreten. (Hinweis: Die USP-Kapitel mit Kennnummer über 1000 sind nicht verbindlich, sondern dienen nur zur Information).
Frage: "Warnstufe = wie erfolgt die Identifizierung? Immer durch 16S rDNA-Sequenzierung?"
Antwort: Ja.
Frage: "Annex 1 besagt, dass die Überwachung von Bioburden erfolgen kann, aber nicht muss. (???) Wie sind Ihre Erfahrungen mit Inspektionen/Zulassungen zu diesem Thema? War das der Grund für die Umstellung auf chargenweise Prüfung oder gab es einen anderen Grund?"
Antwort: In der EMA-Leitlinie zur Sterilisation des Arzneimittels, des Wirkstoffs, des Zusatzstoffs und des Primärbehälters wird eindeutig eine Überwachung der Keimbelastung vor dem finalen Sterilisationsprozess gefordert.
Frage: "Wenn die letzte Bioburden-Probe (aufgrund eines Laborfehlers oder eines anderen Grundes) ausbleibt, würde dies sofort eine Ablehnung der Charge bedeuten, oder könnten dann auch historische Daten eine Sterilitätsprüfung des Endprodukts die Charge retten?"
Antwort: Im Prinzip bedeutet ein fehlendes Bioburden-Ergebnis nicht, dass die Charge abgelehnt werden muss. Das Unternehmen hat die Möglichkeit, eine Risikobewertung durchzuführen. Wenn das Bioburden-Ergebnis einer späten IPC-Probe fehlt - oder sogar das Bioburden-Ergebnis vor dem Sterilfiltrationsschritt - dann wird es wahrscheinlich sehr schwierig sein, die Charge auf der Grundlage einer Risikobewertung freizugeben. Letztendlich entscheidet in Europa die QP und in anderen Ländern die QS-Einheit.
4. Risikobewertung
Frage: "Ist die Risikobewertung von MO, die in einer prozessinternen Bioburdenprüfung für ein steriles Produkt festgestellt werden, eine Anforderung?"
Antwort: Bei der Chargenfreigabe muss jedes Kontaminationsereignis dahingehend untersucht werden, ob es Auswirkungen auf das Produkt und/oder die Patientensicherheit haben könnte und somit die betreffende Charge auf der Grundlage einer Risikobewertung freigegeben werden kann oder nicht.
Frage: "Sind Sie der Ansicht, dass die Dokumentation der Risikobewertung auch den In-Prozess-Kontroll-Bioburden- Test für Zwischenprodukte oder Puffer (für die Herstellung von biopharmazeutischen Wirkstoffen) umfassen sollte?"
Antwort: Ja.
Fragen:
(i) "Könnten Sie einige Schritte für das Nicht-Bioburden- Verfahren erläutern, wenn der Test auf Bioburden nicht durchgeführt wird?"
(ii) "Wenn ein Bioburden-Ergebnis verfehlt wird, behandeln Sie diese Situation als ein nicht konformes Bioburden-Ergebnis?"
Antwort: Die Untersuchung eines fehlenden Bioburden- Ergebnisses ist eine funktionsübergreifende Aktivität, die QC, QA und Produktion einschließt.
• In einem ersten Schritt muss der Grund für das fehlende Bioburden-Ergebnis ermittelt und CAPAs müssen definiert werden.
• Der nächste Schritt besteht darin, die Fähigkeit des Herstellungsprozesses zu bewerten, die Kontamination und/oder mögliche Nebenprodukte zu entfernen. Falls verfügbar, können die folgenden Daten berücksichtigt werden:
- Bioburden-Ergebnisse für die Prozessschritte vor und nach dem Prozessschritt, für den das Bioburden- Ergebnis fehlt
- Trendanalyse und relevante Bioburden-Ergebnisse von zuvor gefertigten Batches
- Endotoxin-Ergebnisse für den ersten Prozessschritt, in dem dieser Test durchgeführt wird, nach der betreffenden Probenart
- Vorlage einer Bewertung der Umwelt-QC-Daten für die Produktionsstätte und das für die Prozessvorgänge verwendete Wasser.
Frage: "Ist eine Bewertung der Patientensicherheit und der Produktqualität für die prozessbegleitende Prüfung von Bioburden in sterilen Produkten vor der Filtration erforderlich?"
Antwort: Nein: Nein - es wird erwartet, dass bei Überschreitung des Grenzwertes für die Keimbelastung die Charge zurückgewiesen werden sollte.
Frage: "Bis zu welchem Grad führen Sie bei der Feststellung einer Bioburden-Warnstufe eine Identifizierung durch (immer auf Spezies-Ebene oder Gram-Charakterisierung)?"
Antwort: Die 16S rDNA-Sequenzierung wird verwendet, da bei der Einzelfallbeurteilung einer Bioburden-Ausschreitung der Kontaminant identifiziert werden muss, um die nächsten Schritte der Beurteilung durchzuführen.
Frage: "PQI-Berechnung. Wird die Verdopplungszeit des Mikroorganismus und die Zeit von der Probenahme bis zum Durchgang des Produkts durch den Filter berücksichtigt, um das theoretisch erreichte Niveau der Keimbelastung zu berechnen? Und wird diese Zahl für die PQI-Berechnung verwendet und nicht die Keimzahl in der Probe?"
Antwort: Nein, die Keimzahl in der Probe ist der relevante Wert.
Frage: "Werden die kritischen Komponenten in der Theorie oder wirklich in der Praxis (mit externen Auftragnehmern) analysiert?"
Antwort: Ja: Es handelt sich um eine Kombination aus Literaturrecherche, experimenteller Studie (Proteomic-Studie), aber auch klinischen Studien.
Frage: "Welche Stabilitätstests werden empfohlen, wenn es keine PQI gibt?"
Antwort: Tests, die die Integrität des Produkts analysieren.
Frage: "Für die Bewertung von Bioburden Excursions können bakterielle DNA und zelluläre Komponenten potenziell von allen Bakterien freigesetzt werden. Das bedeutet, dass für diese Komponenten die Anzahl der Mikroorganismen in der IPC zur Berechnung des Risikos verwendet wird (die mikrobielle ID spielt in diesem Fall keine Rolle)?"
Antwort: Für den Anteil von z .B. Flagellin oder bakterieller DNA verwenden wir generische Werte. Etwa bei Zellwandbestandteilen macht es jedoch einen Unterschied, ob es sich bei dem Kontaminanten um ein grampositives oder gramnegatives Bakterium handelt. Ob und welche Exotoxine ein Kontaminant (potentiell) produziert, lässt sich nur beurteilen, wenn der Kontaminant identifiziert wurde.
Frage: "Was sind die wichtigsten Literaturquellen/Referenzen für die Bewertung der Patientensicherheit?" (Anmerkung: explizite Frage an den Roche-Kollegen)
Antwort: Ein wichtiges Dokument ist das Registry of Toxic Effects of Chemical Substances (RTECS®), Comprehensive Guide to the RTECS, D. V. Sweet Ed., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, 1997.
Frage: "Literatursuche: Finden Sie immer die Informationen über die theoretische Konzentration von PAMPs?"
Antwort: Ja.
Frage: "Proteasen werden bei der PQI-Bewertung bewertet, richtig?"
Antwort: Ja.
Frage: "Wenn das gemeldete Ergebnis der Zählung TNTC ist, gibt es dann einen Worst Case, um eine PQI durchzuführen?"
Antwort: Prinzipiell ja. Aber wir verwenden keine generische Bewertung von Bioburden-Abweichungen. Die Prüfmethode muss in der Lage sein, das ≥ 10-fache des Aktionsgrenzwertes zu quantifizieren. Theoretisch könnte man aber auch eine Berechnung/Bewertung unter der Annahme durchführen, dass eine Kontamination mit 1000 KBE/ ml oder 10.000 KBE/ml eines worst-case Mikroorganismus vorliegt. Das Modell arbeitet auch mit solchen Annahmen.
Frage: "In der Literatur wird von stärkeren Exotoxinen in Bezug auf B. cereus berichtet. Wie bestimmen Sie B. cereus als den schlimmsten Fall?"
Antwort: Nach unserer Kenntnis sind Botulinumtoxine (produziert von Clostridium botulinum) die stärksten bakteriellen Toxine. Gefolgt von Tetanospasmin und Tetanolysin (beide von Clostridium tetani).
Frage: "Wenn die Reduktion der bakteriellen Nebenprodukte nicht gemessen werden kann, wissen wir nicht, ob die theoretisch errechneten Werte in den folgenden Prozessschritten reduziert werden. Warum wird die Stabilität nur empfohlen, wenn es keine weiteren Reduktionsschritte gibt?"
Antwort: Wir wissen aus der Prozessvalidierung, dass zelluläre Komponenten (z. B. Wirtszell-DNA, Wirtszellproteine, ...) während des Downstream-Prozesses entfernt werden. Wir können jedoch nicht genau definieren, wie hoch die Reinigungsrate für bestimmte mikrobiologische Komponenten ist. Daher führen wir die Stabilitätsstudie nur dann durch, wenn in den letzten Schritten des Reinigungsprozesses der Bioburden-Wert unsere vordefinierten Grenzwerte überschreitet.
Frage: "Ist es sicher, das Risiko für jede Komponente separat zu berechnen? Vielleicht haben zwei Komponenten, die beide angeborene Immunreaktionen auslösen, synergistische Effekte? Oder ist dies durch den Worst-Worst-Worst- Case-Aspekt der Berechnungen abgedeckt?
Antwort: Für jede Komponente ist die Berechnung eine "worst-worst-worst"-Annahme. Synergieeffekte werden also nicht berücksichtigt. Dies wird auch von den Gesundheitsbehörden akzeptiert.
5. Bioburden-Testung
Frage: "Regulatorische Erwartungen in Bezug auf die Integrität von Bioburden-Daten. Ist ein zweiter Prüf-Analyst für die Plattenzählung erforderlich?"
Antwort: Theoretisch, ja. Für einige Bioburden-Probenahmestellen könnte die gleichzeitige Verifizierung auf der Grundlage einer Risikobewertung entfallen. Eine Anleitung für eine solche Risikobewertung bietet BioPhorum's RISK ASSESSMENT OF TRADITIONAL CULTURE-BASED MICROBIOLOGICAL TESTS REQUIRING CONTEMPORANEOUS VERIFICATION. Der aktuelle Entwurf der Revision von USP <1117> folgt ebenfalls dieser Philosophie.
Fragen:
(i) "Wenn die Spezifikation des Produkts als kombinierte TAMC- und TYMC-Analyse angegeben werden muss, sollten dann alle Kolonien jeder Platte gezählt, summiert und unabhängig von der Art des Mikroorganismus angegeben werden? Ich meine,
- TAMC: 1 Bakterium und 1 Schimmelpilz - 2 CFU/10 mL
- TYMC. 1 Bakterium und 1 Schimmelpilz - 2 KBE/10 mL
- Endgültiges Ergebnis: Kombinierte TAMC+TYMC: 4 KBE/10 ml?"
(ii) "Was halten Sie von der Summe der TYMC- und TAMC-Ergebnisse, die die EU-Inspektoren manchmal erwarten?"
(iii) "Sie haben in der Vergangenheit TYMC getestet. Wie haben Sie die Ergebnisse gehandhabt? TAMC und TYMC separat im Vergleich zu 10 KBE/100 ml? Oder haben Sie die Summe aus beiden gebildet (wie von einigen Behörden erwartet)?"
Antwort: Weder Roche noch Novartis führen eine TYMC-Zählung durch. Daher ist dieser Aspekt für uns nicht relevant.
Fragen:
(i) "Ist SDA für die Überwachung der einzelnen Schritte des Arzneimittelherstellungsprozesses erforderlich? Oder ist die TYMC-Spezifikation nur für die Produktfreigabe erforderlich?"
(ii) "Wird TYMC wirklich für prozessbegleitende Bioburden- Tests für sterile Produkte erwartet?"
Antwort: Die Gesundheitsbehörden haben akzeptiert, dass wir alle IPC-Stufen und die Arzneimittelsubstanz nur mit TAMC testen.
Fragen:
(i) "Welche Studien müssen durchgeführt werden, um zu beweisen, dass TAMC ausreicht, um die wahrscheinlichsten MO in unserer Umgebung zu finden?"
(ii) "Haben sie Tests entwickelt, um zu beweisen, dass die meisten Hefen und Schimmelpilze unter diesen Inkubationsbedingungen auf TSA wiedergefunden werden können?"
(iii) "Haben sie jemals Tests entwickelt, um zu beweisen, dass Schimmel- oder Hefepilze unter Ihren Inkubationsbedingungen auf TSA wachsen würden?"
Antwort: Wir haben keine spezifischen Studien durchgeführt. Hefen und Schimmelpilze sind in unseren Methodeneignungstests enthalten, und diese Versuche und Ergebnisse waren für die Gesundheitsbehörden ausreichend, um auf den TYMC zu verzichten.
Frage: "Sollten wir die Inkubationsbedingungen ändern, um Hefen und Schimmelpilze auf TSA zu gewinnen?"
Antwort: Nein - wir inkubieren bei 30 - 35 °C.
Fragen:
(i) "Haben Sie irgendwo nachgewiesen, dass die 24 Stunden Haltbarkeitsdauer einer Bioburden-Probe keinen Einfluss auf die Aussagekraft dieser Probe hat?"
(ii) "Sie sagten, dass die Haltbarkeitsdauer von 24 Stunden für Bioburden-Proben nicht immer akzeptiert wird. Könnten Sie einige Beispiele nennen?"
Antwort: Nein - eine Haltbarkeitsdauer von 24 Stunden wurde von den Gesundheitsbehörden ohne unterstützende experimentelle Daten akzeptiert.
Fragen:
(i) "Für die Eignung/Validierung der IPC-Bioburden = wie viele lokale Isolate werden bei wie vielen verschiedenen Chargen verwendet?"
(ii) "Welche Art und Anzahl von lokalen Stämmen fügen Sie dem Wachstumsförderungstest hinzu?"
Antwort: Zwei hauseigene Isolate werden in den Bioburden Method Suitability Test einbezogen.
Frage: "Geben Sie die Inkubationsbedingungen für TAMC an: Temperatur und Dauer?"
Antwort: Die Bedingungen könne in verschiednen Firmen unterschiedlich definiert sein, z. B. 5-7 Tage bei 25-30°C oder 30-35°C für 3-5 Tage. Hinweis: Bei Verwendung eines validierten automatischen Koloniezählers beträgt die Inkubationszeit nur 36 Stunden.
Frage: "Wenn bei der Bioburden-Filtrationsmethode kein Wachstum festgestellt wird, wie soll dann das Ergebnis angegeben werden: 0 CFU/10 ml oder <1 CFU/10 ml bei einer Probe mit einer Spezifikation von ≤10 CFU/10ml?"
Antwort: Sie können entweder 0 KBE/10 ml oder <1 KBE/10 ml angeben. Ihre interne Prüfmethode muss die Berichterstattung definieren.
Frage: "Die Temperatur von 5°C ist für die Keimbelastung wichtiger als die Zeit... wie wäre es also mit einer Haltezeit von maximal 48h, aber bei 5°C und ohne Daten?" (Anmerkung: ausdrückliche Frage an den Kollegen von Novartis)
Antwort: Die Haltedauer der Proben wurde mit zahlreichen Behörden erörtert, und man einigte sich schließlich auf eine Haltedauer von 24 Stunden. Diese Haltedauer ist in den Dossiers beschrieben und wird von den Behörden akzeptiert.
Frage: "Haben Sie Rückstellproben für die Keimbelastung und wie verwenden Sie diese?"
Antwort: "Ja; aber wenn die definierte und hinterlegte Haltbarkeitsdauer der Bioburden-Probe überschritten wird (Anmerkung: 24 Stunden), haben wir keine gültige Probe mehr.
Frage: "Haltezeit für die DP-Freigabe, wenn Sterilitäts- und LAL-Tests gelten? Von der Probenahme bis zur Prüfung sind 24 Stunden vorgeschrieben, aber gibt es eine Haltezeitbeschränkung zwischen Abfüllung und Prüfung?"
Antwort: In der Regel ist für Sterilitätstest-Proben keine Haltezeit definiert. Es sollte eine "Endotoxin-Wiederfindungsstudie" durchgeführt werden, um zu beurteilen, ob irgendwelche probenspezifischen Endotoxin-Maskierungseffekte die Festlegung einer Probenhaltbarkeitsdauer für Endotoxinproben erfordern.
Frage: "Können für die Phase III der Validierung, die drei Chargen (vor der Vermarktung) umfasst, die Ergebnisse der IPC-Routine für die Freigabe verwendet werden, während die Validierungsaktivitäten noch laufen? Oder sollte die Methodenvalidierung, die alle IPC-Schritte umfasst, abgeschlossen sein, bevor die IPC-Routineergebnisse für die Freigabe verwendet werden können?"
Antwort: Alle Validierungsarbeiten müssen vor der Freigabe eines Materials abgeschlossen sein.
Frage: "Was ist der Grund für die von Sven (und anderen) erwähnte Verwendung von Inhouse-Stämmen bei der Methodeneignungsprüfung für Bioburden?" (Anmerkung: explizite Frage an den Kollegen von Roche)
Antwort: Die verwendete Bioburden-Testmethode sollte in der Lage sein, Mikroorganismen nachzuweisen, die für Ihren Herstellungsprozess und die jeweilige Anlage / Herstellungsumgebung relevant sind. Dies wird durch die Einbeziehung repräsentativer betriebsinterner Isolate in Ihren Methodeneignungstest nachgewiesen.
Seminarempfehlung
Karlsruhe18.-20. Juni 2024
Hygienebeauftragte/r (H 1)
6. Rohmaterial / Direkte Materialprüfung
Frage: "Wie sieht es mit der Prüfung von Rohstoffen aus, die für sterile Produkte verwendet werden sollen? Ist bei diesen Rohstoffen keine Prüfung auf unzulässige Organismen erforderlich?"
Antwort: Für biopharmazeutische Herstellungsprozesse sind keine "spezifizierten" Organismen vorgeschrieben. Ausgenommen sind Rohmaterialien, für die eine Monographie existiert. Diese Materialien müssen die Anforderungen der Pharmakopöe erfüllen - und das könnte den Test auf "spezifizierte" Mikroorganismen einschließen.
Frage: "Ist es für die Prüfung der biologischen Belastung von Primärverpackungen wie z. B. flexiblen Beuteln erforderlich, eine Prüfung der Extraktionsleistung durchzuführen und die leere Verpackung auf biologische Belastung zu testen? Oder kann man davon ausgehen, dass es auf die Mikroorganismen ankommt, die in das Produkt extrahiert werden, und dass diese bei der Bioburden-Prüfung des Produkts nachgewiesen werden (wenn man die Bioburden- Prüfung vor der Sterilisation an gefüllten Produkten durchführt)?"
Antwort: Eine Prüfung von sterilen Einwegprodukten ist nicht erforderlich. Der Hersteller kann das Zertifikat des Lieferanten akzeptieren (wenn alle GMP-Anforderungen erfüllt sind, z. B. Qualitätsvereinbarung existiert, Audits durchgeführt wurden, ...).
Frage: "Bezüglich der Methodeneignungsprüfung für den mikrobiellen Keimzahlbestimmungstest bei der Anwendung auf Ausgangsmaterialien. Sollte die Haltezeit zwischen der Zugabe der mikrobiellen Suspension zur Produktlösung und der Filtration der Lösung als Teil des MST quantifiziert werden? Sollte sie einem Worst-Case-Szenario oder einer Obergrenze unterworfen werden?"
Antwort: Der Methodeneignungstest sollte die Bioburden- Prüfung unter Routinebedingungen widerspiegeln. Der Methodeneignungstest sollte gemäß dem einschlägigen General Chapter des Arzneibuchs ohne Vorinkubationsschritt nach Zugabe der Spike-Mikroorganismen durchgeführt werden.
Über die Autoren:
Dr. Sebastian Thölken
... ist Prozessexperte Mikrobiologie, MS&T Steriles bei Novartis Pharma Stein in der Schweiz.
Dr. Sven M. Deutschmann
... ist Head of Global ASAT Adventitious Agents Testing & Alternative Microbiological Methods, Global Analytical Science & Technology bei Roche Diagnostics in Deutschland.
